在制作原代細胞免疫熒光時，容易出現一些問題，造成熒光鑒定失敗，將抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體檢測組織或細胞內的相應抗原（或抗體）時，一定要注意抗體的比例高低和濃度。

制作免疫熒光常用的方法有：

方法一：直接法

步驟：將熒光標記的特異性抗體（抗原）直接加在抗原（抗體）上，經一定的溫度和時間染色，水洗—干燥—封片—鏡檢

優點：操作簡便、特異性高、非特異性染色少

缺點：敏感性低

方法二：間接法

步驟：先用已知未標記的特異性抗體（一抗）與抗原反應，再用標記的抗體（二抗）與其反應，形成抗原—抗體—抗體復合物，水洗—干燥—封片—鏡檢

優點：敏感性強，目前多采用間接法

缺點：操作復雜

實驗過程中常見的問題：

1，整個細胞片都出現熒光高點

原因有二：一是二抗濃度過高，適當降低二抗濃度即可。二是二抗發生沉淀，可以使用過濾或者離心熒光標記二抗

2，信號弱或無信號，染色細胞過少

目標蛋白在細胞中沒有表達，需要制備細胞裂解液，用Western   Blotting驗證目標蛋白在細胞中是否表達。

表達目標蛋白的細胞過少，標本中使用更多的細胞，試用其他瞬時轉染方法，或者使用穩定轉染細胞系。

細胞通透性差，需要增加通透劑作用的時間或者濃度，或改用其它的通透劑

染色前的固定步驟破壞了抗原表位，改用其他固定方法。

通透使抗原丟失，可以減少通透劑作用的時間或強度。

抗體不識別，需要換用其他抗體

一抗稀釋度過大，使用同一樣品按*的二抗用量作一抗稀釋曲線，以確定*的一抗稀釋比例。

二抗選擇錯誤，要使用正確的二抗

3，鏡下觀察只有DAPI的藍光，目的熒光幾乎沒有或者很弱

出現這種現象很有可能是抗體比例太低，需提高抗體濃度，可配合提高二抗濃度；共聚焦的激發熒光強度不夠大；二抗孵育時是否是對應的種屬，比如本來需要山羊抗鼠結果加為山羊抗兔。

4，細胞核周圍總是存在有一些藍色的小點點

這種情況一般是支原體污染所致，建議用殺支原體藥2周后再檢測，或者通過提高共聚焦機器背景值來覆蓋支原體熒光

5，如何共定位的視野

共定位時，首先判斷哪些細胞是轉染成功的，比如我過表達了蛋白A，想做蛋白A和蛋白B的共定位關系，則在視野中尋找已成功轉染蛋白A的細胞，一般熒光強度會顯著高于周邊其他細胞，再在這個細胞上觀察蛋白B的表達。

6，視野中細胞與細胞之間存在散在的發光點

有兩種情況可造成：1，拍照時PBS量過少引起的非特異性；2，PBS未過濾，未溶解的殘渣黏附而導致

三、除此之外，這些注意事項也要牢記

1、合適的抗體稀釋比例

通過優化抗體稀釋比例來優化染色，通常情況下1ug/ml的純化抗體或者1:100-1:1000的抗血清足夠達到特異性染色的結果。但在能保證低背景染色的前提下，可以通過增加濃度來提高信號強度。如果是*次使用該抗體或測定某抗原，強烈建議濃度梯度實驗。

2、抗體特異性

免疫熒光需要用到特異性非常強的抗體，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結果。在大多數情況下，純化抗體的效果很好，但是正確的對照可以幫助定位抗原。使用只有二抗染色的片子

3、細胞固定和通透

為達到*的檢測效果，細胞需要經過固定和通透。這些步驟非常關鍵，細胞和抗原需要保證*的結構，并利于抗體與抗原結合。通常情況下，需要通過以下步驟得以實現：細胞用2%-4%多聚甲醛固定，之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100進行通透。前者是比較溫柔的處理，但是對于核內抗原可能無效，需要用到Triton。使用皂角苷進行通透時，要注意它會引起細胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每個抗體孵育環節都需要進行通透。另外，細胞可以用冰甲醇進行同時固定和通透，可以避免去垢劑的使用。

4、封閉條件的優化選擇

為了防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前用封閉液封閉，這樣可以減少非特異性的背景著色。封閉液可以選擇二抗來源一致的血清，一般來說，血清價格比較昂貴，可以用1%-5%BSA替代，BSA可以說是的封閉血清。另外封閉時間不易過長，30-60min即可，且封閉后不用洗滌，直接加一抗孵育即可。

5、一抗二抗的選擇

封閉過后需要一抗孵育，可以選擇4度過夜孵育或者室溫3h，以筆者的經驗是一抗孵育4度過夜比較好，抗原抗體結合會比較充分。一抗二抗的稀釋比例可以根據抗體說明書來，再根據自己具體的實驗要求進行優化。如果抗體濃度過低，會造成信號太弱，如果抗體濃度過高可能會造成背景染色太強。熒光二抗個人感覺Alex flour熒光基團信號強于Dylight強于FITC。如果做免疫雙標，一抗要來自不同種屬，熒光二抗的光譜也要分開。