IF實(shí)驗

　　免疫熒光技術(shù)

　　原理：免疫熒光技術(shù)是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內的相應抗原（或抗體）。在組織或細胞內形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀(guān)察標本，熒光素受外來(lái)激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見(jiàn)熒光所在的組織細胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。

　　步驟：

　　細胞準備：對單層生長(cháng)細胞，在傳代培養時(shí)，將細胞接種到預先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長(cháng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長(cháng)細胞，取對數生長(cháng)細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。

　　固定：根據需要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。PBS洗滌3×5 min.

　　通透：使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.

　　封閉：使用封閉液對細胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為30min.

　　一抗結合：室溫孵育1h或者4℃過(guò)夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.

　　二抗結合：間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。

　　封片及檢測：滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。